DIJELI | ISPIS | POŠALJI E-POŠTOM
Želim započeti s podsjetnikom koji se često izgubi u javnim raspravama: Cjepiva protiv Covida iRNK su zaista novi medicinski proizvodi.
Prije hitnih odobrenja 2020. godine, tehnologija mRNA cjepiva nikada nije bila primijenjena u velikim razmjerima na ljudima. Samo dva klinička ispitivanja, jedno od Pfizer-BioNTech-a i jedno od Moderne, ikada su testirala ovu platformu na ljudima. Ukupno je otprilike 37 000 pojedinaca ikada primilo mRNA cjepivo u povijesti medicine (ne uključujući ranije iskustvo s cjepivima protiv bjesnoće, CMV-a i raka ograničeno na mnogo manje studije u ranoj fazi). To nije kritika; to je jednostavno izjava činjenice. Ali to znači da je dugoročni sigurnosni profil ovih proizvoda bio i ostao nepotpuno shvaćen.
Ono što slijedi poznato je gotovo svim molekularnim biolozima. Komplicirano je, ali pokušavam pojednostaviti s obzirom na rizik. Važno je jasno izložiti molekularni okvir svima jer način na koji se ta cjepiva izrađuju izravno određuje što se nalazi unutar bočice.. A ono što se nalazi unutar bočice, nakon što se ubrizga, putovat će po cijelom tijelu i aktivirati niz događaja koji mogu dovesti do dugoročnih zdravstvenih posljedica.
In vitro transkripcija nije samo detalj proizvodnje
Modificirana mRNA cjepiva proizvode se postupkom koji se naziva in vitro transkripcija (IVT))IVT je metoda koja se koristi za sintezu modificirane mRNA koja u konačnici postaje aktivni sastojak u cjepivu.
Ovo nije trivijalna tehnička detaljnost. IVT fundamentalno oblikuje molekularni sastav konačnog proizvoda.
Znanstvenici u BioNTechu, uključujući one izravno uključene u razvoj Pfizerovog cjepiva, objavili su detaljan pregled1 opisujući kako IVT reakcije generiraju ne samo namjeravanu mRNA pune duljine, već i niz nusprodukata i nečistoća, kako se oni obično uklanjaju i kakve mogu biti njihove biološke posljedice ako potraju. Ove upute za proizvodnju, zajedno s nusproduktima koje stvaraju, detaljno je opisala i Moderna u svojim patentima (US10,653,712 B2 i US10,077,439 B2). Ali što je još važnije, ova molekularna biologija bila je dobro uspostavljena mnogo prije Covida. Ništa od ovoga nije spekulativno.
Početni materijal: DNK predlošci
U svojoj srži, IVT reakcija započinje dvolančanom DNA koja kodira željeni protein. U ovom slučaju, to je šiljasti protein SARS-CoV-2.
Sekvenca koja kodira šiljak korištena u mRNA cjepivima je genetski modificirani kako bi se poboljšala stabilnost i stanična tolerancija, uključujući dvije zamjene aminokiselina koje ga razlikuju od virusnog šiljka. Ta modifikacija je namjeran.
Sam DNK predložak može poprimiti različite oblike. Tijekom Pfizerovih ranih kliničkih ispitivanja korišteni su PCR-generirani fragmenti DNK. Međutim, komercijalni proizvodni proces oslanjao se na DNK dobivenu iz plazmida. To je važno jer plazmidi sadrže dodatne regulatorne sekvence. U Pfizerovom slučaju, to uključuje elemente poput SV40 promotora i ori sekvenci, koji izazivaju zabrinutost ako bi ušli u ljudske stanice.
Nakon što se ovaj DNA predložak doda IVT reakciji, zajedno s RNA polimerazom i drugim komponentama, transkribira se u mRNA (Slika 1).
IVT proizvodi nusproizvode namjerno
Iako je željeni rezultat IVT-a namjeravani produkt mRNA pune duljine, stvarni rezultat je složeniji. To uključuje različite nusprodukte u obliku (1) različitih vrsta RNA, uključujući dvolančanu RNA (dsRNA), (2) DNA vezane za RNA (RNA-DNA hibridi) i (3) slobodne DNA iz izvornog predloška (Slika 2).
Stvaranje ovih nusprodukata je dobro dokumentirano i neizbježno te je stoga pročišćavanje nakon procesa apsolutno neophodno za sigurnost.
Slika 2. Nusprodukti i onečišćujuće tvari IVT proizvodnje. Slika prilagođena iz 1.
Pročišćavanje ima poznata ograničenja
Nakon proizvodnje potrebna su dva koraka pročišćavanja, prvo se uklanja DNK, a zatim nusprodukti RNK (Slika 3):
Slika 3. Uklanjanje nusprodukata IVT-a. Slika prilagođena iz 2.
Za uklanjanje DNK, reakcijskoj smjesi se dodaje enzim nazvan DNaza I, koji se obično koristi za razgradnju kontaminirajuće DNK. Iako je DNaza I učinkovita protiv slobodne predloške DNK, višestruke studije, uključujući rad samih znanstvenika BioNTecha, pokazuju da je DNaza I neučinkovita u uklanjanju DNK vezane za RNK (RNA-DNK hibridi).
Ovo ograničenje nije kontroverzno. Dokumentirano je u literaturi.
Što su pokazale neovisne analize
Ovaj kontekst je ključan za tumačenje nedavnih neovisnih analiza gotovih bočica cjepiva.
Istraživači3 i regulatori4 izvijestili su o otkrivanju DNA kontaminanata u gotovo svakoj testiranoj bočici. Ti kontaminanti uključivali su i dvolančanu DNA i RNA-DNA hibride koji su se činili otpornima na probavu DNase I.
U nekim uzorcima, DNA koja kodira šiljak bila je prisutna u razinama više od 100 puta većim od ostalih plazmidnih sekvenci.5, što ukazuje na neravnomjernu ili nepotpunu probavu. Sekvenciranjem i kvantitativnom PCR analizom dodatno su otkriveni fragmenti DNA prosječne duljine ~200 baznih parova, s nekima koji prelaze 4 kilobaze. U nekoliko slučajeva uočeni su nizovi koji obuhvaćaju gotovo cijeli plazmid.
Uzeti zajedno, ovi nalazi postavljaju ozbiljna pitanja o dosljednosti i potpunosti pročišćavanja tijekom proizvodnje velikih razmjera te o potencijalnim biološkim posljedicama rezidualnih nukleinskih kiselina kod ljudi.
Zašto su nukleinske kiseline biološki važne
RNA i DNA su snažni aktivatori urođenih imunoloških puteva. Ovo nije nagađanje. Receptori za prepoznavanje obrazaca i cGAS-STING put snažno reagiraju na strane nukleinske kiseline, izazivajući upalu, inhibiciju rasta, pa čak i staničnu smrt.
Upravo su ti mehanizmi razlog zašto su proizvodi genske terapije podložni strogom sigurnosnom nadzoru.
Ironično, cjepiva protiv Covida s mRNA dizajnirana su s modifikacijama posebno kako bi se smanjila ova snažna urođena imunološka aktivacija. No, hibridi RNA-DNA i fragmenti DNA i dalje će izazvati snažne imunološke odgovore unatoč tim modifikacijama.
Upornost postavlja nova pitanja
Sada postoje značajni dokazi koji pokazuju da spike mRNA i protein perzistiraju u ljudskim tkivima tjednima, mjesecima, pa čak i godinama nakon cijepljenja (Tablica 1).
Još ne znamo odražava li ova perzistencija produljenu stabilnost mRNA, kontinuiranu translaciju ili mehanizme temeljene na DNK. No s obzirom na vjerojatnost integracije DNK i dugovječnu neintegriranu plazmidnu DNK u mišićnim stanicama,6 Nije nerazumno pretpostaviti da perzistencija Spike mRNA, proteina i antitijela protiv Spikea godinama nakon cijepljenja nije nepovezana s nečistoćama i nusproduktima DNA nakon IVT-a.
Tablica 1. Perzistencija mRNA i proteina šiljka nakon cijepljenja u ljudi
Kratkoročne i dugoročne sigurnosne implikacije
Uzeti zajedno, ovi podaci pokreću nekoliko važnih sigurnosnih razmatranja.
Prvo, odmah nakon cijepljenja zabilježene su akutne imunološke reakcije, uključujući citokinske oluje i anafilaksiju. Takve snažne upalne reakcije ne treba odmah odbaciti kao nepovezane s nečistoćama, posebno s obzirom na ono što se zna o imunološkoj aktivaciji induciranoj nukleinskim kiselinama.
Drugo, i još kritičnije, su dugoročni rizici. Trajna ekspresija šiljaka mogla bi vjerojatno doprinijeti kroničnim imunološkim sindromima. Još je zabrinjavajuća mogućnost integracije DNK, koja nosi rizike insercijske mutageneze ili poremećaja gena. To znači rizik od raka ili razvojnih mana, ovisno o tome gdje i u kojoj dobi je DNK integriran.
Valja napomenuti da sama FDA u svojim informativnim listovima navodi da ta cjepiva nisu procijenjena je na karcinogenost (stvaranje raka) ili genotoksičnost (oštećenje DNK), što bi bila rutinska i očekivana stvar u nadzoru genske terapije, gdje je dugoročno praćenje standardno.
Regulatorna praznina oko DNK u mRNA cjepivima
Budući da više nema spora oko toga da rezidualna DNA postoji u mRNA cjepivima, pitanje je jesu li trenutne smjernice i sigurnosna ograničenja prikladni za mRNA cjepiva. Uvjereni smo da su nusprodukti DNA unutar ograničenja utvrđenih u regulatornim smjernicama. Dakle, kakve su smjernice FDA u vezi s nusproduktima DNA i kontaminantima?
Najčešće citirane smjernice FDA o rezidualnoj DNA (≤10 ng po dozi) razvijene su za virusna cjepiva proizvedena u živim stanicama koje su fragmentirane i „gole“, s ograničenom sposobnošću ulaska u ljudske stanice. Međutim, mRNA cjepiva se ne proizvode u stanicama, njihova rezidualna DNA nije izvedena iz stanice domaćina i, što je najvažnije, DNA u mRNA cjepivima nije gola. Povezana je sa sustavima dostave LNP-a, koji posebno olakšavaju ulazak DNA u stanice. Smjernice FDA iz 2010. jasno navode da ne uspostavljaju relevantan sigurnosni prag za DNA povezan s proizvodima na bazi LNP-a.
Druge često citirane smjernice su od WHO-a za rekombinantnu proteinsku terapiju koja se odnosi na rezidualnu DNA u proizvodima poput monoklonskih antitijela ili hormona proizvedenih u genetički modificiranim stanicama. Ovdje ponovno rezidualna DNA potječe iz stanica domaćina ili ekspresijskih plazmida, prisutna je kao trag, nekapsulirana DNA (gola), a konačni proizvod je pročišćeni protein, a ne terapija na bazi nukleinske kiseline (mRNA cjepivo). Dakle, ove smjernice se ne odnose na mRNA cjepiva.
Niti regulatorni standardi FDA niti WHO-a koji se najčešće citiraju za rezidualnu DNK nisu bili razvijeni za mRNA cjepiva i ne rješavaju izravno ovo sigurnosno pitanje.
Što je WHO rekao o mRNA cjepivima - nakon primjene
Svjetska zdravstvena organizacija je 2022. godine izdala smjernice koje se posebno odnose na mRNA cjepiva.7Značajno je da je ovaj dokument objavljen nakon globalno uvođenje ovih proizvoda. Izričito se navodi da su ove smjernice donesene kao odgovor na: „sigurnosna, proizvodna i regulatorna pitanja povezana s ovom novom tehnologijom.Dokument također sadrži nekoliko važnih izjava:
"Budući da detaljne informacije o metodama korištenim za proizvodnju još nisu dostupne, kontrole još nisu standardizirane za sigurna i učinkovita mRNA cjepiva, a određeni detalji ostaju vlasnički i stoga nisu javno dostupni, u ovom trenutku nije izvedivo razviti specifične međunarodne smjernice ili preporuke."
Dalje se navodi: „Detaljne postupke proizvodnje i kontrole... treba raspraviti s NRA-om i odobriti ga] od slučaja do slučaja."
WHO priznaje da kontrole za mRNA cjepiva još nisu standardizirane i da nije bilo izvedivo uspostaviti specifične međunarodne smjernice ili preporuke. Nadalje, potreban je regulatorni nadzor za procjenu svakog slučaja pojedinačno od strane nacionalnih tijela.
To je navedeno nakon što su mRNA cjepiva bila raspoređena..
I do trenutka pisanja ovog članka, FDA još uvijek nije uspostavila standardizirane smjernice za mRNA cjepiva niti pružila bilo kakve dokaze i podatke o sigurnosti koji bi potkrijepili bilo kakva ograničenja DNA u mRNA cjepivima.
Konačno, vrijedi ponoviti: iako mRNA tehnologija nije nova, prije Covida bila je regulirana kao genska terapija, a ne kao tradicionalno cjepivo. Sigurnosna pitanja vezana uz nusprodukte DNA u cjepivima protiv Covida bit će ista kao i kod bilo kojeg mRNA cjepiva, uključujući ona za gripu, RSV ili čak mRNA cjepiva za rak.
To je zato što su mRNA produkti fundamentalno drugačiji. Moraju ući u stanice i uputiti ih da proizvode strani protein. To je za razliku od bilo kojeg drugog konvencionalnog cjepiva koje izravno isporučuje protein. Ne postoji klinički presedan za ovu platformu, a ne postoji ni klinički presedan za ponovljeno doziranje. A zasigurno nema presedana na razini populacije.
U ovoj fazi, bez pandemije, s akumuliranim mehanističkim podacima i kliničkim opažanjima te širenjem mRNA cjepiva na tržište, potrebna nam je transparentnost i izravno sudjelovanje regulatora, posebno FDA-e, u ozbiljnim studijama sigurnosti, koje uspostavljaju ključne smjernice za proizvodnju ovih proizvoda - posebno kada je riječ o nusproduktima DNK.
Nova tehnologija zahtijeva novu provjeru – a ne šutnju, gaslighting ili cenzuru.
Reference
1 https://www.frontiersin.org/journals/molecular-biosciences/articles/10.3389/fmolb.2024.1426129/full
2 Webb C, Ip S i dr. Mol Pharm. 4. travnja 2022.;19(4):1047-1058. doi: 10.1021/
3 https://www.tandfonline.com/doi/10.1080/08916934.2025.2551517?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed
4 https://www.tga.gov.au/resources/publication/tga-laboratory-testing-reports/summary-report-residual-dna-and-endotoxin-covid-19-mrna-vaccines-conducted-tga-laboratories.
5 https://zenodo.org/records/17832183; https://www.scstatehouse.gov/CommitteeInfo/SenateMedicalAffairsCommittee/PandemicPreparedness/Phillip-Buckhaults-SC-Senate-09122023-final.pdf
6 Wang i sur. (2004.) – „Otkrivanje integracije plazmidne DNA u genomsku DNA domaćina nakon intramuskularne injekcije i elektroporacije“ (Gene Therapy, 2004.). Kod miševa je intramuskularno ubrizgana gola plazmidna DNA, nakon čega je uslijedila elektroporacija radi poboljšanja apsorpcije. Korištenjem visoko osjetljive PCR na pročišćenoj genomskoj DNA (s gel separacijom za uklanjanje ekstrakromosomskih oblika), autori su identificirali četiri neovisna događaja integracije 4 tjedna nakon injekcije. Sekvenciranje spojeva potvrdilo je nasumična mjesta integracije (bez preferencijalnih žarišnih točaka), što je u skladu s nehomolognim spajanjem krajeva. Učestalost integracije bila je niska, ali mjerljiva. Ovo je jedna od najjasnijih demonstracija stvarnih spontanih događaja integracije in vivo za golu plazmidnu DNA u mišiću. Važno je napomenuti da je ova studija koristila poboljšanu dostavu DNA putem elektroporacije koja se može usporediti s poboljšanom dostavom putem LNP-ova.
Martin i sur. (1999.) – „Cjepivo protiv malarije s plazmidnom DNA: Potencijal za genomsku integraciju nakon intramuskularne injekcije“ (Human Gene Therapy). Ova ranija studija testirala je plazmidnu DNA IM u miševa i koristila Southern blot hibridizaciju i PCR na genomskoj DNA visoke molekularne težine kako bi se ispitala integracija. Iako je perzistencija uglavnom bila ekstrakromosomska, izvijestili su o dokazima koji upućuju na rijetku integraciju u nekim uzorcima (iako ne tako definitivno sekvencirani kao kasniji radovi). Postavila je mjerilo za nizak rizik, ali je priznala potencijal za događaje vrlo niske učestalosti, što je utjecalo na naknadne smjernice FDA o DNA cjepivima.
Ledwith i sur. (2000.) – „Cjepiva s plazmidnom DNA: Istraživanje integracije u staničnu DNA domaćina nakon intramuskularne injekcije u miševa“ (Intervirology). Ogoljena plazmidna DNA ubrizgana IM u miševa pokazala je i iako nije uočena uočena uočljiva integracija, DNA je i dalje detektirana u mišiću kvadricepsa do 26 tjedana. DNA je bila ekstrakromosomska.
7 Stručni odbor WHO-a za biološku standardizaciju, 74. izvješće, Prilog 3. Evaluacija kvalitete, sigurnosti i učinkovitosti cjepiva s informacijskom RNA za sprječavanje zaraznih bolesti: regulatorna razmatranja https://cdn.who.int/media/docs/default-source/biologicals/vaccine-standardization/annex-3—mrna-vaccines_who_trs_1039_web-2.pdf
-
Dr. Charlotte Kuperwasser je ugledna profesorica na Odjelu za razvojnu, molekularnu i kemijsku biologiju Medicinskog fakulteta Sveučilišta Tufts i direktorica Tufts Convergence Laboratoryja na Tuftsu. Dr. Kuperwasser je međunarodno priznata po svojoj stručnosti u biologiji mliječnih žlijezda i raku dojke te prevenciji. Članica je Savjetodavnog odbora za imunizacijske prakse.
Pogledaj sve postove
